Le monoxyde d’azote : de la recherche fondamentale aux applications cliniques

La découverte en 1987 que les cellules endothéliales vasculaires libéraient du monoxyde d'azote (NO) et que celui-ci était produit à partir d'un acide aminé, la L-arginine, mit en évidence un nouveau système biologique ubiquitaire. NO , synthétisé à partir d'une famille d'enzymes, les NO synthases, joue un rôle essentiel dans de multiples fonctions physiologiques. Dans le système vasculaire, il maintient un tonus vasodilatateur nécessaire pour la régulation de la circulation sanguine et le contrôle de la pression artérielle. Le monoxyde d’azote produit par l’endothélium ou les plaquettes inhibe aussi l’agrégation et l’adhésion des plaquettes. Il empêche l’adhésion des leucocytes et module la prolifération des cellules musculaires lisses. NO joue un rôle homéostatique dans les fonctions vasculaires et une diminution de sa synthèse ou de ses effets contribue au développement de certaines pathologies vasculaires.

NO est aussi synthétisé dans les neurones du système nerveux central, où il agit comme un neuromédiateur impliqué dans diverses fonctions physiologiques telles que la formation de la mémoire, la coordination entre l’activité neuronale et le débit sanguin et la modulation de la douleur. Dans le système périphérique nerveux, il est bien établi que NO est le médiateur libéré des terminaisons nerveuses connues précédemment comme non-adrénergiques et non-cholinergiques. Ces innervations médient certaines formes de vasodilatations neurogéniques, régulent les fonctions gasto-intestinales, respiratoires ou génitales. Toutes ces actions physiologiques du NO sont médiées par l’activation de la guanylate cyclase soluble entraînant une augmentation de la concentration de cyclic GMP dans les cellules cibles. D’autre part, NO est produit en grande quantité lors des réactions de défense de l’organisme. Une telle libération du NO fut premièrement observée dans des macrophages activés où il participe aux défenses de l’organisme vis-à-vis des cellules tumorales, des bactéries, des virus et d’autres microorganismes pathogènes. Libéré de cette manière, NO participe au développement de plusieurs pathologies comme le choc septique et certaines formes d’inflammation aiguë ou chronique. Ainsi NO est un médiateur biologique ubiquitaire dont les fonctions passent de fonctions physiologiques à des mécanismes pathophysiologiques. L’Euroconférence de l’Institut Pasteur présentera les derniers développements en recherche sur le NO. Il est fortement probable que de nouvelles thérapeutiques émergeront. Les différentes cibles thérapeutiques potentielles et les dernières avancées scientifiques dans chacun de ces thèmes seront les principaux sujets de cette conférence.

Nitric Oxide: Basic research and clinical applications

The discovery in 1987 that endothelial cells release nitric oxide (NO) and the subsequent identification of its generation from the amino acid L-arginine revealed the existence of a ubiquitous biochemical pathway. NO is formed by a family of enzymes, the NO synthases, and plays a role in many physiological functions. Its formation in vascular endothelial cells maintains a vasodilator tone that is essential for the regulation of blood flow and pressure. NO produced by the endothelium and/or platelets also inhibits platelet aggregation and adhesion, inhibits leukocyte adhesion and modulates smooth muscle cell proliferation. Thus NO plays a role as a homeostatic regulator of vessel wall functions and a decrease in its synthesis or actions contributes to the development of some vascular pathologies.

NO is also synthesized in neurons of the central nervous system, where it acts as a neuromediator with several physiological functions, including the formation of memory, coordination between neuronal activity and blood flow, and modulation of pain. In the peripheral nervous system, NO is now known to be the mediator released by a widespread network of nerves, previously recognized as nonadrenergic and noncholinergic. These nerves mediate some forms of neurogenic vasodilation and regulate certain gastrointestinal, respiratory and genitourinary functions. All these physiological actions of NO are mediated by activation of the soluble guanylate cyclase and consequent increase in the concentration of cyclic guanosine monophosphate in target cells.

In addition, NO is generated in large quantities during host defense and immunological reactions. Such generation of NO was first observed in activated macrophages, where it contributes to their cytotoxicity against tumor cells, bacteria, viruses and other invading microorganisms. When NO is released in this way it contributes to the development of certain pathologies, including septic shock and some forms of acute and chronic inflammation. Thus NO is a widespread biological mediator whose functions range from physiological processes to pathophysiological mechanisms. This Institut Pasteur Euroconference will review the latest developments in the research on many of these topics. In addition, as the research is progressing, it is becoming evident that new therapies will develop from this knowledge. The different potential therapeutic targets and the progress to date in each of the areas will be the main foci of the conference.

Le monoxyde d'azote en biologie : bilan de dix ans de recherche

La découverte en 1987 que les cellules endothéliales vasculaires libéraient du monoxyde d'azote (NO) et que celui-ci était produit à partir d'un acide aminé, la L-arginine, mit en évidence un nouveau système biologique ubiquitaire. NO, synthétisé à partir d'une famille d'enzymes, les NO synthases, joue un rôle essentiel dans de multiples fonctions physiologiques. Dans le système vasculaire, il maintient un tonus vasodilatateur nécessaire pour la régulation de la circulation sanguine et le contrôle de la pression artérielle. Dans le système nerveux central, il agit comme un neuromédiateur, participant à l'acquisition de la mémoire, coordonnant de nombreuses activités neuronales, régulant le flux sanguin, modulant la douleur. Dans le système nerveux périphérique, NO est libéré par des terminaisons nitrergiques qui médient la vasodilatation neurogénique et qui régulent certaines fonctions des systèmes gastro-intestinal, respiratoire et urogénital. De plus, NO est libéré en grandes quantités lors de certaines réactions immunologiques ou de défenses contre des microorganismes et est impliqué dans la physiopathologie du choc septique et de l'inflammation. Cette conférence présentera comment NO peut passer d'un médiateur physiologique à un effecteur physiopathologique à travers ces différents effets sur la fonction mitochondriale.

Nitric Oxide as a Biological Mediator: A Ten Year Perspective

The discovery in 1987 that endothelial cells release nitric oxide (NO) and the subsequent identification of its generation from the amino acid L-arginine revealed the existence of a ubiquitous biochemical pathway. NO is formed by a family of enzymes, the NO synthases, and plays a role in many physiological functions. In the vasculature it maintains a vasodilator tone that is essential for the regulation of blood flow and pressure. In the central nervous system it acts as a neuromediator whose functions include the formation of memory, coordination between neuronal activity and blood flow, and modulation of pain. In the peripheral nervous system NO released by nitrergic nerves mediates some forms of neurogenic vasodilation and regulates certain gastrointestinal, respiratory and genitourinary functions. In addition, NO is generated in large quantities during host defense and immunological reactions and is involved in the pathogenesis of conditions such as septic shock and inflammation. The presentation will discuss how NO may be transformed from a physiological mediator to a pathophysiological entity through different actions on mitochondrial function.

Structure et fonction de la NO synthase inductible

En générant de grandes quantités de NO, la NO synthase inductible (iNOS) participe à la défense contre les microganismes pathogènes mais elle peut être délétère en contribuant à la destruction de tissus au cours de pathologies autoimmunes. Une meilleure compréhension de la structure de l'iNOS et de son activité catalytique peut nous aider à trouver des moyens sélectifs de contrôler la synthèse du NO. L'étude de cette enzyme peut aussi nous permettre de comprendre pourquoi cette enzyme possède une structure dimérique, nécessite la tétrahydro.bioptérine comme co-facteur catalytique et peut catalyser deux activités séquentielles monooxygénasiques pour transformer la L-arginine en NO. La détermination de la structure cristalline ainsi que des études biochimiques et de mutagénèse dirigée ont permis de détailler les interactions entre les différentes sous-unités protéiques et entre la protéine et ses cofacteurs : substrats ou inhibiteurs. Un modèle prenant en compte les aspects structuraux et les mécanismes de synthèse et de régulation du NO sera présenté.

Structure-function studies of inducible NO synthase

The cytokine-inducible NO synthase (iNOS) participates in host defense by generating NO in response to microbial pathogens, but may also contribute to tissue destruction associated with autoimmune disorders. A better understanding of iNOS structure and how it relates to enzyme function may provide a means to selectively control NO synthesis, and may explain why the enzyme requires a dimeric structure, tetrahydrobiopterin as a cofactor, and can catalyze two distinct, sequential monooxygenase reactions to convert L-arginine to NO. Ongoing crystal structure, mutational, and biochemical studies are revealing in detail the essential interactions between the protein subunits and domains, and between the protein and its cofactors, substrates, and inhibitors. A model that relates these structural aspects to the mechanism of NO synthesis and catalytic control will be presented.

Régulation de la libération du monoxyde d'azote (NO) dérivé de l'endothélium à partir de la localisation subcellulaire et d'interaction protéine-protéine

NO, dérivé de l'endothélium est un médiateur très important de nombreuses fonctions du système cardiovasculaire. De façon physiologique, les cellules endothéliales fabriquent NO à partir de NO synthase endothéliale (eNOS ou NOSIII). eNOS est une protéine membranaire ciblant dans la région du Golgi et de microdomaines plasmiques appelés cavéoles des cellules endothéliales grâce à des modifications post-translationnelles de lipides c'est-à-dire par N-myristoylation et cystéine palmitoylation. Des mutations spécifiques préviennent eNOS de l'acylation, empêchent le ciblage de cette enzyme dans le Golgi ou dans des domaines des cavéoles des cellules endothéliales et par conséquent diminuent de façon importante la production de NO. Cependant, ces mutations n'affectent pas l'activité catalytique de l'enzyme in vitro suggérant qu'une compartimentalisation de eNOS est nécessaire pour une synthèse optimale de NO. En plus de ce ciblage sub-cellulaire, des interactions protéine-protéine avec la cavéoline, la protéine de surface des cavéoles endothéliales ainsi qu'avec de nouvelles protéines identifiées seront discutées.

Regulation of Endothelial-derived NO release by subcellular localization and Protein-Protein interactions

Endothelial-derived NO has emerged as a critical mediator of diverse functions in the cardiovascular system. Physiologically, endothelial cells manufacture NO via the enzyme endothelial nitric oxide synthase (eNOS or NOS III). eNOS is a peripheral membrane protein that targets into the Golgi region and plasmalemmal microdomains, termed caveolae, of endothelial cells by co- and post-translational lipid modifications, namely N-myristoylation and cysteine palmitoylation. Point mutations that specifically prevent eNOS fatty acylation prevent the targeting of the enzyme to Golgi and caveolae domains of endothelial cells and markedly diminish the stimulated production of NO. Moreover, tnese mutations do not impair the catalytic activity of the enzyme in vitro suggesting that compartmentalization of eNOS is necessary for optimal NO synthesis. In addition to subcellular
targeting, protein-protein interactions with caveolin, the coat protein of endothelial caveolae and newly identified proteins will be discussed.

Régulation des NO synthases par la tétrahydrobioptérine

Les NO synthases (NOS) sont des enzymes uniques et complexes du type cytochrome P450s. Les trois isoformes des NOS se présentent sous forme de protéines homodimériques avec des sous-unités (130-160 kDa) contenant un site catalytique hémique lié à un domaine flavine réductase par un site de liaison à la calmoduline. A la différence des autres cytochromes P450, les NOS ont besoin de la tétrahydrobioptérine (H4 Bioptérine) qui sert à la fois de régulateur allostérique et de co-facteur redox dans la réaction d'oxydation de la L-arginine. La liaison spécifique et anti-coopérative d'une ou deux molécules de ptérine sur chacun des dimères de la NOS conduit à des activités enzymatiques qui libèrent du NO et de l'anion superoxide à différentes concentrations selon la quantité de H4 bioptérine libre. Les connaissances actuelles sur le rôle de la H4 bioptérine en tant que co-facteur des NOS et les conséquences fonctionnelles de la liaison complexe de la ptérine seront présentées.

Regulation of nitric oxide synthase by tetrahydrobiopterin

The nitric oxide synthases (NOS) are unique, highly complex cytochrome P450s. All three isoforms are homodimeric proteins with each subunit (130 - 160 kDa) containing a catalytic heme domain that is linked to a flavin-containing reductase domain via a calmodulin recognition site. Unlike any other cytochrome P450, NOS requires the pterin derivative tetrahydrobiopterin (H4biopterin) that functions as both allosteric regulator and redox-active cofactor in L-arginine oxidation. The highly specific, anticooperative binding of either one or two pterin molecules to dimeric NOS yields different enzyme species which generate NO and superoxide at varying ratios, depending on the concentration of free H4biopterin. The current knowledge on the role of H4biopterin as a NOS cofactor and the functional consequences of the complex pterin binding behavior will be reviewed.

Activation calcium-indépendante de la NO synthase endothéliale

Les forces de cisaillement au niveau de l'endothélium stimulées par le flux sanguin pulsatile libèrent de façon permanente du monoxyde d'azote (NO). Le NO module localement le tonus vasculaire et contrôle les systèmes de signalisation cellulaires et géniques. La forme constitutive de la NO synthase endothéliale (eNOS) peut être stimulée par une augmentation de (Ca2+)i qui elle-même résulte d'une stimulation de récepteurs tels que celui de l'acétylcholine ou de la bradykinine. Mais aussi, eNOS peut être activée par les forces de cisaillement en l'absence d'une augmentation de (Ca2+)i via un mécanisme dépendant des tyrosine kinases qui implique sa redistribution dans le complexe cytoskelette/cavéole et l'activation d'une ou de plusieurs protéines de régulation de l'eNOS.

Calcium-independent activation of the endothelial nitric oxide synthase

Mechanical forces generated at the endothelium by pulsatile blood flow are important in ensuring the continuous release of nitric oxide (NO) which modulates local vascular tone as well as cell signalling and gene expression. The constitutive endothelial NO synthase (eNOS), can be activated in response to an increase in [Ca2+]i following stimulation with receptor-dependent agonists such as acetylcholine and bradykinin. However, eNOS can also be activated by shear stress in the absence of a maintained increase in [Ca2+]i via a tyrosine kinase-dependent mechanism involving its redistribution within the cytoskeleton/caveolae and the activation of one or more regulatory eNOS-associated proteins.

Inhibiteurs et activateurs des ptérines et synthèse du NO

Les fonctions biochimiques des NO synthases (NOS) sont proches de celles du système cytochrome P450/NADPH dépendant/cytochrome P450 réductase. Cependant une différence essentielle avec le cytochrome P450 est l'utilisation pour toutes les NOS de tétrahydrobioptérine (H4bioptérine) pour exprimer une activité maximale. De plus, le site de liaison de la ptérine à la NOS est différent de celui des hydroxylases des acides aminés aromatiques, une famille de H4bioptérine enzyme impliquée dans la biosynthèse des neurotransmetteurs. Les inhibiteurs et les activateurs du type ptérine sont intéressants comme outils biochimiques pour comprendre la fonction de H4bioptérine dans la synthèse du NO et peuvent aussi servir de molécules thérapeutiques potentielles pour moduler la synthèse du NO.

Many of the biochemical features of NO synthases resemble the cytochrome P450/NADPH-dependent cytochrome P450 reductase system. One important variation of this is the requirement of all NOS for exogenous tetrahydrobiopterin (H4biopterin) for maximal activity. The reason for this is unclear. Moreover, the NOS pterin binding site appears to be distinct from that of aromatic amino acid hydroxylases, a large family of H4biopterin-requiring enzymes involved in neurotransmitter biosynthesis. Thus, pterin-based inhibitors and activators of NOS are both interesting biochemical tools to elucidate the function of H4biopterin in NO synthesis and potential drug candidates to modulate NO synthesis.

Régulation de la guanylate cyclase

La guanylate cyclase soluble agit en tant que récepteur pour le monoxyde d'azote et médie une grande partie de ses effets physiologiques. L'effet activateur du monoxyde d'azote est médié par l'interaction avec le groupe hémique de cette enzyme. Un nouveau mécanisme de régulation de la guanylate cyclase soluble vient d'être identifié. Le dérivé synthétique YC-1 augmente l'activité catalytique, sensibilise l'enzyme aux effets activateurs du monoxyde d'azote et transforme CO en un activateur puissant de la guanylate cyclase soluble.

Regulation of soluble guanylyl cyclase

Soluble guanylyl cyclase acts as the receptor for nitric oxide, thereby mediating many effects of the signaling molecule. The stimulatory effect of nitric oxide is mediated by interaction with the prosthetic heme group of the enzyme. A new mechanism of modulation of soluble guanylyl cyclase activity has been identified: The compound YC-1 increases the maximal catalytic rate, sensitizes the enzyme towards its activator nitric oxide and turns CO into an effective activator of soluble guanylyl cyclase.

Le rôle du NO dans l'apoptose

La formation de grandes quantités de monoxyde d'azote (NO) est potentiellement cytotoxique. Nous avons pu montrer qu'une activation de la NOS inductible ou un apport exogène (donneurs de NO) entraînait une mort cellulaire apoptotique mesurée par des critères morphologiques (condensation de la chromatine) ou biochimiques (accumulation de P53, modification de l'expression de BCL2, activation des caspases). La sensibilité au NO peut néanmoins varier considérablement selon les cellules. NO peut agir comme un inducteur ou un régulateur de l'apoptose, et être la marque d'une cytoprotection. L'effet protecteur est observé lorsque NO se lie à l'anion superoxyde qui est produit simultanément. L'interaction NOO2 est cytoprotectrice tant que le glutathion réduit peut compenser le stress oxydatif résultant. De plus, NO peut aussi médier l'expression de gènes protecteurs qui eux-mêmes modulent l'action du NO dans l'apoptose

The Role of Nitric Oxide in Apoptosis

The production of large amounts of nitric oxide (NO) is potentially cytotoxic. Following its endogenous (iNOS activation) or exogenous (NO donors) formation we noticed apoptotic cell death as revealed by distinctive morphological (chromatin condensation) and biochemical (tumor suppressor p53 accumulation, altered Bcl-2 expression, caspase activation) criteria. However, cellular sensitivity to NO varies considerably and NO appears to act both as a direct apoptotic effector and as a regulator of the death program. As a result NO also signals cell protection. Protective principles arise when NO-signaling is attenuated by the simultaneous production of superoxide (O2-). The NO/O2- interaction may channel destructive pathways towards protection as long as reduced glutathione compensates the resultant oxidative stress. Furthermore, NO can also mediate gene expression of protective proteins which modulates the role of NO in apoptotic cell death.

Effet du monoxyde d'azote (NO) sur la synthèse et l'atteinte de l'ADN.

NO et ses produits d'oxydation, N2O3 et le peroxynitrite, ont des effets importants sur l'état des cellules ainsi que sur leur survie et leur mode de réplication. L'effet sur la synthèse de l'ADN résulte d'une inhibition de la ribonucléotide réductase et d'une dépletion de NADPH. L'atteinte de l'ADN peut conduire : à l'arrêt de la prolifération, à des mécanismes de réparation, à des mutations ou de l'apoptose. NO peut aussi inhiber l'apoptose. L'association d'une atteinte de l'ADN entraînant une mutation et d'une inhibition de l'apoptose peut se révéler un mécanisme typique de la progression des cellules souches d'un état normal à un état cancéreux. Les mécanismes d'atteinte de l'ADN par le NO inclut des cassures de brins, des "cross-links" ou des modifications des bases. Ces processus et ceux des mécanismes de réparation seront présentés

Effects of NO on DNA Damage and DNA Synthesis

NO and its oxidation products, N2O3 and peroxynitrite, may have profound effects on the physiological state of exposed cells and on their ability to either replicate or survive. Effects on DNA synthesis result from inhibition of ribonucleotide reductase and depletion of NADPH. DNA damage may lead to any of the following: cell cycle arrest, DNA repair, mutation, or apoptosis. NO may also inhibit apoptosis. Combination of DNA damage leading to mutation combined with inhibition of apoptosis is an ideal mechanism for progression of stem cells from normal to cancerous states. The mechanisms of DNA damage via NO include strand breaks, crosslinks, and base modification. These processes along with mechanisms of repair will be reviewed.

Inhibition enzymatique: l'exemple des aconitases

Une large variété d'enzymes présentent à leur site actif un métal ou des groupes thiol qui sont des cibles naturelles de NO ou de ses dérivés. Un exemple de l'interaction entre NO et les métalloenzymes est donné par l'inhibition des aconitases mitochondriale et cytosolique des mammifères. L'activité de ces enzymes qui convertissent le citrate en isocitrate est contrôlée par un centre polymétallique Fe-S qui participe à la catalyse. Il est remarquable que la perte d'activité de l'aconitase cytosolique en réponse à NO reflète sa conversion en une protéine trans-régulatrice qui contrôle le métabolisme du fer. Ce rôle régulateur de NO a des implications probables dans l'expression génique, la bioénergétique et l'homéostasie du fer.

A diverse array of enzymes have an active site that comprises metal ions or cysteine thiol group(s) which are amongst the favorite targets of NO. Interaction between NO and metalloenzymes is exemplified by inhibition of mitochondrial and cytosolic aconitases. These enzymes possess a dynamic Fe-S cluster which catalyses hydration of citrate to isocitrate. It is worth noting that loss of cytosolic aconitase activity upon exposure to NO is accompanied by conversion of the aconitase to an RNA-binding protein which controls iron metabolism. This regulatory role of NO may have important implications for gene expression, energy metabolism and iron homeostasis.

Réactivité biologique du peroxynitrite

Le peroxynitrite (ONOO-), le produit de combinaison du monoxyde d'azote NO et de l'anion superoxyde (O.-) est une molécule cytotoxique très réactive impliquée dans des pathologies qui vont de l'athérosclérose aux maladies neurodégénératives. Le peroxynitrite induit l'oxydation et la nitration de molécules d'intérêt biologique les affectant dans leurs fonctions. Les cibles intracellulaires du peroxynitrite comprennent les thiols et les centres de métaux lourds. Une autre activité du peroxynitrite in vivo qui est cependant mineure implique la formation de radicaux hydroxyles (OH.) qui peut initier toute une chaîne de réactions radicalaires comme la peroxydation lipidique. Enfin, la réaction du peroxynitrite avec le dioxyde de carbone conduit à un dérivé (ONOO CO2.) qui reconduit à la réactivité du peroxynitrite. La formation de ce dérivé constitue le principal chemin biochimique du peroxynitrite dans le milieu extracellulaire. Dans notre communication, nous présenterons les principales réactions biologiques du peroxynitrite et leur application dans le dysfonctionnement cellulaire et la mort cellulaire.

Biological reactions of peroxynitrite

Peroxynitrite (ONOO-), the reaction product of the free radicals nitric oxide (.NO) and superoxide (O2-), is a reactive and cytotoxic biomolecule that has been recently implicated in a variety of disease states that range from atherosclerosis to neurodegeneration. Peroxynitrite oxidizes and nitrates biomolecules leading to changes in their biological functions. Preferential intracellular targets of peroxynitrite include thiols and metal centers. A minor pathway of peroxynitrite reactivity in vivo involves the formation of hydroxyl radicals (.OH) which can initiate radical chain processes such as lipid peroxidation. Finally, the reaction of peroxynitrite with carbon dioxide yields an adduct (ONOO CO2 -) which redirects peroxynitrite reactivity. Formation of this adduct constitutes the main reaction pathway of peroxynitrite in the extracellular milieu. In the presentation we will address the key biological reactions of peroxynitrite and their relevance in cellular dysfunction and death.

Les souris "knock out" NOS : un moyen de déchiffrer les mécanismes de neurodégénération et d'action des molécules

Cette présentation évoquera l'intérêt des souris transgéniques n'exprimant pas l'une ou l'autre forme des isoformes de NO synthase constitutive. Les souris transgéniques sont utiles pour disséquer le rôle du monoxyde d'azote et de ses produits de réaction au niveau cérébral sur des animaux pris dans des conditions physiologiques (mesure des débits du cerveau et du métabolisme), pharmacologiques (mesure de la vasorelaxation endothélium-dépendante) ou pathologiques (ischémie cérébrale et trauma cérébral). Cette communication présentera les derniers résultats publiés sur le rôle et l'importance de ces souris notamment la "up-regulation" sélective de la forme eNOS dans l'endothélium vasculaire.

The importance of NOS knockout mice to decipher mechanisms of brain injury and drug action

This presentation will focus on the importance of mutant mice expressing a deletion in one or more of the constitutively expressed isoforms of NOS. Such animals were useful to dissect the role of nitric oxide and its reaction products in normal and injured brain under physiological (coupling between flow and metabolism), pharmacological (endothelial dependent relaxation), and pathological (cerebral ischemia and brain injury) conditions. This presentation will summarize published data and present new information about the importance of these mice to selective upregulation of eNOS within vascular endothelium.

NO, PARP et les autres effecteurs impliqués dans l'infarctus cérébral et les maladies neurodégénératives

Le monoxyde d'azote (NO) en s'associant avec l'anion superoxyde forme le peroxynitrite, une molécule neurotoxique endogène. Une production excessive de NO d'origine neuronale joue un rôle important dans l'infarctus cérébral. La majorité des effets toxiques semble résulter de l'activation de la polyADP ribose polymérase (PARP) qui déplètent les neurones de leur stock d'ATP par consommation de NAD. L'inhibition du NO, et de la PARP pourraient devenir des traitements prometteurs de l'ischémie cérébrale et des pathologies neurodégénératives.

Nitric Oxide, PARP and Other Perpetrators Relevant to Stroke and Neurodegeneration

Nitric Oxide (NO) in combination with the superoxide anion forms peroxynitrite, an important endogenous neurotoxin. Excess production of neuronally derived NO plays an important role in stroke damage and the majority of NO's toxic action seems to occur through activation of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) which depletes neurons of their energy stores through consumption of NAD. Inhibition of NO and PARP may hold particular promise for the treatment of stroke as well as neurodegenerative disorders.

Inhibiteurs sélectifs de la NOS inductible

Le monoxyde d'azote a montré depuis dix ans qu'il jouait un nombre important de rôles biologiques agissant en tant que signal intracellulaire, signal transcellulaire ou molécule cytotoxique de défense ou inflammatoire. NO est formé à partir de L-arginine par les NO synthases (NOS) qui sont connues sous trois isoformes : nNOS (neuronale), eNOS (endothéliale) et iNOS (inductible). Alors que les formes nNOS et eNOS ont d'importantes fonctions physiologiques, la forme iNOS a montré qu'elle était induite et impliquée dans la pathologie d'une grande variété de maladies. Des inhibitions sélectives de iNOS peuvent par conséquent avoir des applications thérapeutiques dans certaines de ces pathologies.

Selective Inhibitors of iNOS

Nitric oxide has been shown over the last decade to play an unprecedented range of roles in biological systems, acting as an intracellular signal, a transcellular signal or as a cytotoxic host defence/inflammatory molecule. It can be formed from L-arginine by the nitric oxide synthase (NOS) enzymes, of which there are three known isoforms: nNOS (predominantly neuronal), eNOS (endothelial) and iNOS (inducible). Whereas nNOS and eNOS have important physiological roles in the body, iNOS has been shown to be induced and implicated in the pathology of a range of diseases. Selective inhibition of iNOS may thus have therapeutic potential in these diseases.

Inhibiteurs des NO synthases et neurotoxicité

De nombreuses études suggèrent que le monoxyde d'azote (NO) est impliqué dans les processus neurotoxiques observés dans les pathologies neurodégénératives telles que l'ischémie cérébrale, la maladie de Parkinson ou la maladie d'Huntington.La neurotoxicité du NO est essentiellement due à sa capacité à réagir avec l'anion superoxide pour former un oxydant puissant, le peroxynitrite. Le blocage de cette neurotoxicité peut être obtenu à l'aide d'inhibiteurs sélectifs des NOS synthases (neuronale inductible) ; ceux-ci se révèlent des agents neuroprotecteurs très efficaces dans les modèles pathologiques chez l'animal ouvrant de nouvelles voies thérapeutiques dans les pathologies neurodégénératives.

Nitric oxide synthase inhibitors and neurodegenerative diseases

Accumulating evidence has implicated nitric oxide (NO) and reactive oxygen radicals in the pathogenesis of neurodegenerative diseases like cerebral ischemia, Parkinson's disease, Huntington's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Peroxynitrite which is formed by the reaction of NO and superoxide anion is responsible for the major part of NO induced neurotoxicity. Thus blocking NO mediated toxicity in the central nervous system is potentially neuroprotective. This can be achieved by using selective inhibitors of NO synthases (neuronal or/and inducible). A neuroprotective strategy using selective NOS inhibitors may prove useful in stopping or slowing the progression of neurodegenerative diseases. This is supported by studies in experimental models which will be presented in the conference.

NO et poumons

Les trois formes de NO synthases sont exprimées dans le poumon humain. eNOS est importante pour la régulation de la circulation bronchique et pulmonaire et est impliquée dans la vasoconstriction pulmonaire hypoxique et dans la l'hypertension pulmonaire. nNOS qui est exprimée dans les terminaisons nerveuses (plus particulièrement parasympatiques) est un neurotransmetteur bronchodilatateur. iNOS est sur-exprimée dans les voies aériennes dans des pathologies inflammatoires comme l'asthme, la bronchectasie et la fibrose alvéolaire. Toutes ces pathologies sont associées avec une augmentation de NO dans l'air exhalé. La mesure du NO exhalé apparaît comme une méthode non invasive pour mesurer l'inflammation dans les poumons et la réponse à des thérapeutiques anti-inflammatoires.

NO in the lungs

All three NO synthases are expressed in human lung. eNOS is important for regulation of bronchial and pulmonary blood flow and is implicated in hypoxic pulmonary vasoconstriction and pulmonary hypertension. nNOS is expressed in nerves (particularly parasympathetic) and is the major bronchodilator neurotransmitter. iNOS is expressed in normal airways but there is increased expression in inflammatory disease such as asthma, bronchiectasis and fibrosing alveolitis, all of which are associated with increased NO in exhaled air. Exhaled NO appears to be a non-invasive means of monitoring inflammation in the lung and its response to antiinflammatory therapies.

Monoxyde d'azote inhalé : expériences cliniques et précliniques

Depuis 1991, de nombreuses études et observations cliniques ainsi que des études chez l'animal ont montré une amélioration de l'échange de l'oxygène et une diminution de la vasoconstriction pulmonaire pendant l'inhalation de monoxyde d'azote (NO) dans des états d'atteinte aiguë pulmonaire ou d'hypertension pulmonaire. Des effets intéressants sont observés pour des doses allant de 0,1 à 100 parts de NO/million. La plus petite dose étant celle de la quantité de NO produit de manière endogène dans les voies supérieures et auto-inhalée. La plus forte dose peut être associée à des effets secondaires. Les résultats d'études randomisées multicentriques chez l'adulte et le nouveau-né seront présentés.

Inhaled nitric oxide: experimental and clinical experiences

Since 1991 numerous clinical studies and anecdotes as well as animal experiments have described improved oxygen exchange and reduction of lung vascular constriction during nitric oxide (NO) inhalation in states of acute lung injury and pulmonary hypertension. Interesting effects are seen in the dose range 0.1-100 parts per million NO, the lower range being similar to the amount of NO produced endogenously in the upper airways and autoinhaled. The upper dose range can be associated with adverse effects. Results from randomised multicenter studies in adults and neonates will also be reviewed.

Le NO et l'impuissance

La relaxation des muscles lisses du corps caverneux et la réduction du tonus artériolaire constituent les mécanismes de l'érection. Le NO est un puissant médiateur de la relaxation du muscle lisse vasculaire et non-vasculaire et serait un médiateur essentiel de la réponse érectile. Pharmacologiquement, la réduction du tonus vasculaire à travers l'antagonisme des récepteurs alpha adrénergiques peut égalemement contribuer à la réponse. Il sera démontré que l'incorporation d'un donneur de NO aux antagonistes alpha-adrénergiques augmente ces effets relaxants. Ces molécules représentent une nouvelle classe d'agents thérapeutiques potentiels pour le traitement de l'impuissance.

Nitric Oxide and Male Impotence

Penile erection involves relaxation of corpus cavernosal smooth muscle as well as a reduction of arteriolar vasoconstrictor tone. Nitric oxide is a potent mediator of vascular and non-vascular smooth muscle relaxation and considered a key mediator of the erectile response. Pharmacologically, the reduction of vascular tone via antagonism of alpha receptors can also contribute to the response. Data to be presented will show that enhancement of the relaxant actions of alpha receptor antagonists can be achieved by incorporating the properties of nitric oxide donation. These molecules represent a new class of potential therapeutic agents for the treatment of male impotence.

Manipulations génétiques de la voie du monoxyde d'azote : thérapie génique avec la NOS

L'augmentation de l'expression de la NO synthase (NOS) localement et donc du NO représente une stratégie thérapeutique intéressante de transfert de gènes pour traiter les pathologies prolifératives vasculaires. Pour mesurer l'effet biologique d'une transfection de la NOS endothéliale sur la formation de lésions vasculaires in vivo, nous avons utilisé le modèle de lésions au ballonnet sur la carotide de rat. Nous avons pu démontrer que l'expression transgénique de eNOS permettait une diminution de 70 % de la formation néointimale après transfection deux semaines après lésions avec le ballonnet. De plus, la production de NO dans le lit vasculaire augmente significativement la réactivité du vaisseau. Cette étude apporte des arguments pour des essais thérapeutiques utilisant in vivo un transfert de gène direct d'un cDNA codant pour la NO synthase. La forme inductible NOS (NOSII) a été clonée dans les vecteurs d'expression de mammifères et aussi étudiée pour ses effets thérapeutiques dans des pathologies vasculaires. Une étude récente a démontré qu'une expression augmentée de iNOS supprimait le développement de l'athérosclérose après transplantation cardiaque expérimentale. Nous avons également trouvé que l'adhésion des monocytes aux carotides arthéroscléreuses des rats hypercholestérolémiques était significativement réduite par l'expression augmentée de iNOS.Les derniers résultats sur le transfert de gènes des NOS seront présentés et le potentiel des thérapies géniques utilisant le NOS sera discuté.

Genetic Manipulation of Nitric Oxide Pathway: NOS Gene Therapy

Overexpression of NO synthase (NOS) with subsequent increased local NO production represents an attractive tool for therapeutic gene transfer to treat vascular proliferative disorders. To assess the biological response to transfection of the endothelial NOS (ec-NOS) gene on vascular lesion formation in vivo we used the rat carotid artery balloon injury model and demonstrated that ec-NOS transgene expression resulted in a 70% inhibition of neointima formation after balloon injury at 2 weeks after transfection. In addition, production of NO within the vessel wall was restored and the vascular reactivity of the vessel was significantly improved. The inducible iNOS cDNA has been cloned into mammalian expression vectors and has also been investigated for its therapeutic effects in vascular disease. A recent study has demonstrated that overexpression of iNOS suppressed the development of allograft arteriosclerosis after experimental cardiac transplantation. We have also found that monocyte adhesion to atherosclerotic carotid arteries of hypercholesterolemic rabbit vessels was significantly reduced by overexpression of iNOS. Recent results of NOS gene transfer studies will be presented and the potential of gene therapy strategies using NOS will be discussed.